Ny kunskap om hur RNA rör sig kan bidra till nya läkemedel mot cancer

Forskare vid Karolinska Institutet rapporterar i tidskriften Nature att de har funnit ett helt nytt tillvägagångssätt som korta RNA-molekyler använder för att styraproduktionen av proteiner inne i cellerna. Studien visar att en RNA-molekyl, som spelar en viktig roll i cancer, kan påverka sin aktivitet genom att förändra sin struktur. Upptäckten öppnar för helt nya strategier att behandla olika typer av cancer.

Korta RNA-molekyler i våra celler som kallas mikroRNA reglerar aktiviteten hos budbärar-RNA (mRNA) – molekylen som kodar för byggstenarna i vår kropp, proteinerna. Exakt hur denna reglering går till är inte känt i detalj, men man vet att mikroRNA kan tysta mRNA-molekyler och därmed förhindra proteinproduktion. Därför kan de användas som verktyg eller mål för läkemedelsbehandling, skriver Katja Petzold, docent vid Institutionen för medicinsk biokemi och biofysik vid Karolinska Institutet, som lett studien.

P53, proteinet som är känt som genomets portvakt och en viktig cancerregulator, aktiverar transkription avmikroRNA 34a (miR-34a) och är i en återkopplingsslingareglerad av miR-34a, riktad mot Sirt1, som inaktiverar
p53. MiR-34a tillhör den klass av mikroRNA som reglerar proteinuttryck via RNA-induced silencing complex – RISC. RISC består av proteinet Argonaute (här hAgo2) som är laddat med en guide-RNA (en miRNA). Guiden kodar information för målet, som behöver regleras, i de första åtta baserna, så kallade seed-sequence. Om seed består av de åtta Watson-Crick-basparen regleras miRNA mest effektivt, och tills nu har man inget annat medel för att förutsäga miRNA-effektiviteten annat än genom sekvensen av seed – åtta av 22 nukleotider av hela mikroRNA.

KÄRNMAGNETISK RESONANS
Vi utforskade därför hur hela miRNA-sekvensen, dess struktur och även strukturändring förklarar regleringseffektiviteten av miRNA med exemplet miR-34a. Vi studerade strukturen av mikroRNA och dess förändringar, för vi vet att en struktur i sig själv inte kan förklara funktionen. Man kan tänka sig det som att en bild av en stängd sax som ser ut som en dolk, bara om den öppnar sig får den funktionen att skära. Tidigare har man sagt att en struktur relateras till en funktion, men nu måste vi utveckla det mer: en RNA-molekyl behöver ändra sin struktur för att uppfylla sina funktioner. En RNA-molekyl kan även ha flera olika strukturer som kan relatera till olika funktioner eller växla mellan att sätta på och stänga av funktionen. I vår studie använde vi kärnmagnetisk resonans (NMR, magnetröntgens atom-upplösta syskon) för att avslöja attmiR-34a ändrar sin struktur via en ändring i basparning(bild, övre del). Vi använde ett avancerat NMR-experiment som heter R1􀈡 relaxation dispersion, som kan mäta rörelse av en atom och olika tillstånd/strukturer av denna atom, därtill olika tillstånd som hela miRNA kan befinna sig i.

Dessa tillstånd kallar vi exalterade tillstånd, för att de har lite mer energi, motsvarande en vätebindning, än grundtillståndet. Grundtillståndet är strukturen man kan avbilda med experiment som Kryo-EM eller röntgenkristallografi och är RNA:s mest stabila tillstånd, som molekylen spenderar mest tid i. Exalterade tillstånd är i kemisk jämvikt med grundtillståndet och finns bara under ett ögonblick, till och med kortare än en blinkning. Vi har upptäckt att miR-34a, som formar ett komplex med budbärar-RNA (mRNA) av Sirt 1 (silent information regulator 1: mSirt1), existerar i två olika tillstånd (bilden). Grundtillståndet, som finns 99 % av tiden, och det exalterade tillståndet, som finns 1 % av tiden och har en livslängd på ungefär en millisekund. De två tillstånden är ganska lika och i grundtillståndet är seed bara 6.5 baspar långt (övre del i bilden), vilket förklarar varför den inte nedreglerar så bra. Med ett byte av detta baspar från en Watson-Crick GC till en wobble GU baspar förlängs seed till åtta baspar och gör komplexen maximalt aktiva. Seed-förlängning möjliggör också att resten av miR- 34a kan binda mSirt1 (undre del i bilden) och därför intensifieras hela aktiviteten av RISCen vidare. Strukturen och dynamiska ändringar av strukturen är mätt i en in vitro-miljö, som betyder att den är i en minimalistisk omgivning med bara vatten och salt i små glasrör.

Därför behövde vi visa att denna ändring verkligen händer i en naturlig miljö, i humancellerna. Vi använde en ljusbaserad cellanalys baserad på ett protein som kallas Luciferase, som producerar lika mycket ljus som det finns luciferase- proteinmolekyler. Vi testade detta i HEK-celler och det visade sig att det exalterade tillståndet verkligen var mer aktivt. Grundtillståndet har en förmåga att nedreglera mSirt1 till 50 % av mängden och det exalterade tillståndet kan nedreglera mSirt1 dubbelt så mycket. Dock är det inte lika mycket som man hade förväntat sig från in vitro NMRexperimenten, där skillnaden mellan tillstånden är 100 gånger. Troligt är att jämvikten mellan tillstånden i cellerna inte är densamma som i in vitro-experimentet, till exempel kan grundtillståndet i cellerna bara bli 66 % och det exalterade tillståndet 33% (och därför får vi bara dubbelt så mycket nedreglering), då vi inte vet hur cellernas miljö påverkar jämvikten som vi har studerat. En intressant detalj är att energiskillnaden mellan det två tillstånden är pytteliten, om man bara ändrar lite pH, salt, proteinkoncentration eller någonting annat, kan jämvikten ändra sig helt och snabbt. Därför tror vi att det kan bli en snabb regleringsmekanism i cellerna.

Läs hela artikeln